सूक्ष्मजीवों को उगाना (संवर्धन)
सूक्ष्मजीवों को पढ़ने के लिए हम उन्हें उगाते हैं। संवर्धन माध्यम (culture medium) उनका भोजन है। अगर एक जेली है जो पेट्री डिश में जम जाती है; उसमें पोषक तत्व मिलाते हैं। सब कुछ निर्जर्म (sterile) होता है और हम सावधानी से काम करते हैं ताकि दूसरे जीव अंदर न जाएँ: यह ऐसेप्टिक तकनीक है। नमूना फैलाने के बाद प्लेट इन्क्यूबेटर, यानी गरम डिब्बे में रखी जाती है (शरीर के कीटाणुओं के लिए लगभग 37 °C)।
मिश्रित नमूने (जैसे मिट्टी) में कई तरह के जीव होते हैं। चयनात्मक माध्यम (selective medium) में कुछ ऐसा होता है जो केवल मनचाहे जीव को उगने देता है (जैसे नमक, रंग या कोई एंटीबायोटिक जिसे बाकी सह नहीं पाते)। विभेदक माध्यम सबको उगने देता है पर रंग से फ़र्क दिखाता है। चयनात्मक प्लेट की बस्तियों को बार-बार रेखा खींचकर फैलाते हैं जब तक शुद्ध संवर्धन (एक ही तरह का) न मिल जाए।
वृद्धि वक्र और वृद्धि पर नियंत्रण
जीवाणु दो भागों में बँटकर बढ़ते हैं। शोरबे की नलिका में उनकी संख्या वृद्धि वक्र (growth curve) की चार अवस्थाओं से गुज़रती है:
- लैग (विलंब): कोशिकाएँ भोजन की आदत डालती हैं; बढ़ोतरी कम।
- लॉग (चरघातांकी): बार-बार दोगुनी होती हैं। n बार दोगुना होने पर N = N₀ × 2ⁿ।
- स्थिर: भोजन घटता है, अपशिष्ट बढ़ता है; जन्म और मृत्यु बराबर।
- मृत्यु: जन्म से ज़्यादा कोशिकाएँ मरती हैं।
वृद्धि रोकने के लिए रोगाणुरोधी पदार्थ काम आते हैं: disinfectant (वस्तुओं पर), antiseptic (त्वचा पर), एंटीबायोटिक (शरीर के अंदर)। एंटीबायोग्राम एक जीव को कई एंटीबायोटिक पर परखता है। जीव को प्लेट पर फैलाते हैं, दवा में भीगी टिकियाँ रखते हैं और इन्क्यूबेशन के बाद साफ़ अवरोध क्षेत्र नापते हैं। बड़ा क्षेत्र = संवेदनशील (S); क्षेत्र नहीं या बहुत छोटा = प्रतिरोधी (R); बीच का = मध्यवर्ती (I)। डॉक्टर S वाली दवा चुनता है।
सूक्ष्मजीवों की पहचान
पहचान सुराग जोड़ने का जासूसी काम है, सरल से विशिष्ट की ओर।
- आकृति (रूप): बस्ती का रंग और आकार; सूक्ष्मदर्शी में कोशिका का आकार (गोलाणु = गेंद, दंडाणु = छड़, सर्पिल = स्प्रिंग) और समूह (जोड़े, लड़ियाँ, गुच्छे)।
- ग्राम अभिरंजन: कोशिकाओं को बैंगनी रंग से रंगकर धोते हैं। मोटी भित्ति वाली ग्राम-पॉज़िटिव कोशिकाएँ बैंगनी रखती हैं। पतली भित्ति वाली ग्राम-नेगेटिव रंग खो देती हैं और गुलाबी प्रतिरंजक लेती हैं।
- उपापचयी परीक्षण (जीव क्या करता है): कैटालेज़ परीक्षण (हाइड्रोजन परॉक्साइड से बुलबुले), ऑक्सीडेज़ परीक्षण, क्या वह शर्करा किण्वित करता है (रंग बदलना), क्या सिट्रेट इस्तेमाल करता है। कई छोटे कुओं वाली पट्टी एक साथ कई परीक्षण करती है।
रणनीति: पहले सस्ते, तेज़ परीक्षण (ग्राम रंजन और आकार), फिर कुछ उपापचयी परीक्षण जो बचे विकल्पों को बाँटें, और पैटर्न को तालिका या कुंजी से मिलाएँ। पुष्टि हमेशा शुद्ध संवर्धन पर करें।
सूक्ष्मजीवों की गिनती
सूक्ष्मदर्शी से सीधी गिनती। एक विशेष स्लाइड (गणना कक्ष) पर जाली होती है; एक बड़े वर्ग के ऊपर का आयतन ज्ञात होता है (जैसे 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 10⁻⁴ mL)। कई वर्गों में कोशिकाएँ गिनकर औसत लेते हैं। कोशिकाएँ प्रति mL = प्रति वर्ग औसत ÷ आयतन। तेज़ है, पर मृत कोशिकाएँ भी गिनी जाती हैं।
ठोस संवर्धन के बाद गिनती (प्लेट-गिनती)। नमूने को क्रम से पतला करते हैं (1 mL को 9 mL में डालने से 1 : 10, यानी 10⁻¹, फिर 10⁻², …)। ज्ञात आयतन (जैसे 0.1 mL) प्लेटों पर फैलाते हैं। इन्क्यूबेशन के बाद उस प्लेट की बस्तियाँ गिनते हैं जिसमें 30 से 300 बस्तियाँ हों: कम हो तो भरोसा नहीं, ज़्यादा हो तो आपस में मिल जाती हैं।
CFU/mL = बस्तियाँ × (1 ÷ तनुता) ÷ फैलाया गया आयतन। यह केवल जीवित कोशिकाओं को गिनता है जो बस्ती बना सकती हैं।
खुद करके देखें
3D में: चरण 5 में तनुता खिसकाएँ। उत्तर पढ़ने से पहले अंदाज़ा लगाएँ कि कौन-सी प्लेट "गिनने लायक" है। फिर जाँचें कि हरे घेरे वाली प्लेट में 30 से 300 बस्तियाँ हैं। फिर चरण 2 में चयनात्मक अगर पर टिक लगाएँ/हटाएँ और हर बार बस्तियाँ गिनें।
घर पर (सुरक्षित): एक गिलास पानी में खाने के रंग की एक बूँद डालें। उसमें से 1 चम्मच लेकर 9 चम्मच साफ़ पानी में मिलाएँ और देखें रंग कितना हल्का हुआ। तीन बार करें। क्रमिक तनुता कोशिकाओं की संख्या के साथ यही करती है। घर पर कीटाणु न उगाएँ; यह केवल शिक्षक के साथ कक्षा की प्रयोगशाला में करें।
मुख्य सूत्र और परिभाषाएँ
- N = N₀ × 2ⁿ (n = दोगुना होने की संख्या = समय ÷ दोगुना होने का समय)
- CFU/mL = बस्तियाँ × तनुता-गुणक ÷ फैलाया आयतन (mL)
- 10⁻ᵉ वाली प्लेट के लिए तनुता-गुणक = 10ᵉ
- सीधी गिनती: कोशिकाएँ/mL = प्रति वर्ग औसत ÷ वर्ग का आयतन (mL)
- 30 से 300 बस्तियों वाली प्लेट ही चुनें
हल किए गए उदाहरण
1. एक जीवाणु हर 30 मिनट में दोगुना होता है। 3 घंटे बाद (बिना लैग) कितनी कोशिकाएँ?
3 घंटे = 180 मिनट = 6 बार दोगुना। N = 1 × 2⁶ = 64 कोशिकाएँ।
2. 10⁻³ प्लेट पर 0.1 mL फैलाने से 142 बस्तियाँ मिलीं। CFU/mL निकालिए।
CFU/mL = 142 × 10³ ÷ 0.1 = 1.42 × 10⁶।
3. 10⁻⁴ प्लेट पर 1 mL फैलाने से 45 बस्तियाँ मिलीं। CFU/mL निकालिए।
45 × 10⁴ ÷ 1 = 4.5 × 10⁵ CFU/mL।
4. एक ही नमूने की प्लेटें: 10⁻² में >300, 10⁻³ में 142, 10⁻⁴ में 15। कौन-सी गिनेंगे?
केवल 10⁻³ प्लेट 30 से 300 की सीमा में है। 10⁻² में भीड़ है, 10⁻⁴ में बहुत कम।
5. अवरोध क्षेत्र: A = 24 mm, B = 16 mm, C = 8 mm, D = 0 mm। कौन-सी दवाएँ चुनेंगे?
A और B के क्षेत्र बड़े हैं: जीव संवेदनशील है। C कमज़ोर। D का क्षेत्र नहीं, यानी जीव D के प्रति प्रतिरोधी है। पहले A चुनें।
6. गणना कक्ष के एक वर्ग का आयतन 10⁻⁴ mL है। औसत 25 कोशिकाएँ प्रति वर्ग। कोशिकाएँ/mL निकालिए।
25 ÷ 10⁻⁴ = 2.5 × 10⁵ कोशिकाएँ/mL।
7. नमूने को तीन बार पतला किया, हर बार 1 mL को 9 mL में। तनुता क्या है?
हर चरण 1 : 10 है, इसलिए तीन चरणों के बाद 10⁻³ यानी 1 : 1000।
8. एक गुलाबी, छड़ जैसा, कैटालेज़-पॉज़िटिव जीव मिला। सुराग क्या कहते हैं?
गुलाबी यानी ग्राम-नेगेटिव, छड़ यानी दंडाणु; कैटालेज़-पॉज़िटिव से कुछ समूह हट जाते हैं। आगे शर्करा और सिट्रेट परीक्षण करके तालिका से मिलाएँगे।
आम गलतियाँ
- 500 बस्तियों वाली प्लेट गिनकर उस पर भरोसा करना। केवल 30 से 300 भरोसेमंद है।
- CFU/mL के सूत्र में तनुता-गुणक या फैलाया गया आयतन भूल जाना।
- यह सोचना कि ग्राम रंजन से प्रजाति का नाम मिल जाता है। यह केवल जीवों को दो समूहों में बाँटता है।
- कक्षा में अज्ञात जीवों वाली प्लेट खोलना। उसे बंद रखें और ऐसेप्टिक तकनीक अपनाएँ।