DNA als Erbmaterial
Griffith (1928), Transformation: Lebende, harmlose R-Typ-Streptococcus pneumoniae + hitzegetötete, tödliche S-Typ-Bakterien → die Mäuse starben, und man fand lebende S-Bakterien. Etwas aus den toten S-Zellen hatte R in S „umgewandelt“.
Avery, MacLeod und McCarty (1944): Sie zerstörten nacheinander Bestandteile des S-Extrakts. Eiweiß abbauende Enzyme (Proteasen) und RNase stoppten die Transformation nicht; DNase schon. Also war der Wirkstoff die DNA.
Hershey und Chase (1952): Sie züchteten Bakteriophagen mit radioaktivem ³²P (landet in der DNA) oder ³⁵S (landet im Protein). Nach der Infektion und dem Schütteln im Mixer enthielten die Bakterien ³²P, aber kein ³⁵S. Also gelangt die DNA, nicht das Protein, in die Zelle und trägt die Bauanleitung.
Was macht ein gutes Erbmaterial aus?
- Es kann sich selbst kopieren (replizieren).
- Es ist chemisch und strukturell stabil.
- Es kann sich langsam verändern (mutieren), das braucht die Evolution.
- Es kann sich in Merkmalen zeigen, die nach Mendel vererbt werden.
RNA ist weniger stabil (ihre 2′-OH-Gruppe macht sie reaktiv), deshalb speichert DNA Information besser; RNA eignet sich besser für schnelle Aufgaben. RNA war wahrscheinlich das erste Erbmaterial (RNA-Welt).
Aufbau von DNA und RNA
Ein Nukleotid = stickstoffhaltige Base + Pentose-Zucker + Phosphat. Base + Zucker = Nukleosid. Purine: Adenin (A), Guanin (G). Pyrimidine: Cytosin (C), Thymin (T, nur in DNA), Uracil (U, nur in RNA). Der DNA-Zucker ist Desoxyribose, der RNA-Zucker ist Ribose.
Nukleotide verbinden sich durch 3′–5′-Phosphodiesterbindungen. Watson und Crick (1953) entwickelten mithilfe der Röntgenbilder von Rosalind Franklin und Wilkins die Doppelhelix:
- Zwei Stränge, antiparallel (5′→3′ und 3′→5′).
- A=T (2 H-Brücken), G≡C (3 H-Brücken). Ein Purin steht immer einem Pyrimidin gegenüber, daher bleibt die Breite bei 2 nm.
- Rechtsgängige Windung, eine Windung = 3,4 nm = 10 Basenpaare, Abstand zwischen den Paaren 0,34 nm.
- Chargaff-Regel: A = T und G = C, also (A + G) = (C + T).
RNA ist meist einsträngig. Typen: mRNA (Botschaft), tRNA (Adapter), rRNA (Teil des Ribosoms).
Verpackung der DNA
Länge der DNA = Anzahl der Basenpaare × 0,34 nm. Diploide menschliche Zelle: 6,6 × 10⁹ bp × 0,34 × 10⁻⁹ m ≈ 2,2 m, gepackt in einen Zellkern von etwa 10⁻⁶ m Breite.
- Prokaryoten: kein Zellkern. Die negativ geladene DNA wird von positiv geladenen Proteinen in einem Bereich namens Nukleoid in Schleifen gehalten.
- Eukaryoten: Die (negative) DNA wickelt sich um Histone (positiv, reich an Lysin und Arginin). Acht Histone bilden ein Histon-Oktamer; etwa 200 bp DNA wickeln sich darum = ein Nukleosom. Nukleosomen in einer Reihe sehen aus wie „Perlen an der Schnur“ → Chromatinfaser → weiter gewickelt → Chromosom in der Metaphase. Nicht-Histon-Chromosomenproteine (NHC) helfen bei der weiteren Verpackung.
Euchromatin: locker gepackt, hell angefärbt, aktiv. Heterochromatin: dicht gepackt, dunkel angefärbt, inaktiv.
DNA-Replikation (semikonservativ)
Watson und Crick sagten voraus, dass jeder Strang als Vorlage dient. Meselson und Stahl (1958) bewiesen es: Sie züchteten E. coli in schwerem ¹⁵N und setzten sie dann in normales ¹⁴N um. Nach 1 Generation war alle DNA ein Hybrid (¹⁵N–¹⁴N); nach 2 Generationen war die Hälfte Hybrid, die Hälfte leicht. Taylor zeigte dasselbe in Wurzelspitzen der Saubohne mit radioaktivem Thymidin.
Wie läuft es ab?
- Die Helikase öffnet die Helix am Replikationsursprung und bildet eine Y-förmige Replikationsgabel.
- Die DNA-abhängige DNA-Polymerase fügt Nukleotide nur in 5′→3′-Richtung an und nutzt dafür Desoxynukleosidtriphosphate (sie liefern Baustein und Energie zugleich).
- An einem Strang wächst die neue DNA ohne Pause (Leitstrang); am anderen entsteht sie in kurzen Stücken (Folgestrang, Okazaki-Fragmente).
- Die DNA-Ligase verbindet die Stücke.
Sie ist sehr schnell (E. coli kopiert 4,6 × 10⁶ bp in etwa 18 Minuten, etwa 2000 bp pro Sekunde) und sehr genau. Bei Eukaryoten findet sie in der S-Phase statt.
Zentrales Dogma
Francis Crick schlug vor, dass genetische Information von DNA → RNA → Protein fließt. DNA → DNA ist die Replikation, DNA → RNA ist die Transkription, RNA → Protein ist die Translation.
Reverse Transkription (RNA → DNA) kommt bei manchen Viren wie HIV vor und nutzt das Enzym Reverse Transkriptase. Der Fluss kann also manchmal rückwärts laufen (umgekehrtes zentrales Dogma).
Transkription
Nur ein Strang wird abgeschrieben. Der Matrizenstrang (3′→5′) wird gelesen; der andere ist der codierende Strang (5′→3′), der dieselbe Sequenz wie die RNA hat, nur mit T statt U.
Eine Transkriptionseinheit besteht aus einem Promotor (stromaufwärts, dort bindet die RNA-Polymerase), dem Strukturgen und einem Terminator.
Bei Bakterien
Eine einzige RNA-Polymerase bildet alle RNAs. Mit dem σ-(Sigma-)Faktor beginnt sie (Initiation), sie verlängert die RNA (Elongation), und mit dem ρ-(Rho-)Faktor hört sie auf (Termination). Transkription und Translation können gleichzeitig ablaufen, weil es keinen Zellkern gibt.
Bei Eukaryoten
- RNA-Pol I → rRNAs (28S, 18S, 5.8S); RNA-Pol II → hnRNA (Vorstufe der mRNA); RNA-Pol III → tRNA, 5S-rRNA, snRNA.
- Gene sind gestückelt: Exons (werden exprimiert) und Introns (dazwischenliegend). Die hnRNA wird bearbeitet: Beim Spleißen werden die Introns entfernt; beim Capping wird am 5′-Ende Methylguanosintriphosphat angehängt; beim Tailing werden am 3′-Ende 200–300 Adenine angehängt (Poly-A-Schwanz).
Genetischer Code
George Gamow überlegte: 4 Basen müssen 20 Aminosäuren codieren. 4¹ = 4 und 4² = 16 sind zu wenig; 4³ = 64 reicht. Der Code ist also ein Triplett. Nirenberg, Khorana und Ochoa fanden die Codons heraus.
- 64 Codons: 61 codieren Aminosäuren, 3 sind Stopp-Codons (UAA, UAG, UGA).
- AUG = Methionin und zugleich das Start-Codon (doppelte Aufgabe).
- Eindeutig und spezifisch: ein Codon → eine Aminosäure.
- Degeneriert: viele Aminosäuren haben mehr als ein Codon.
- Wird ohne Lücken in einem fortlaufenden Raster gelesen.
- Fast universell: UUU = Phe bei Bakterien und Menschen (wenige Ausnahmen in Mitochondrien).
Mutationen und der Code
Eine Punktmutation (eine Base verändert) kann eine Aminosäure verändern (Sichelzellanämie). Das Einfügen oder Entfernen von 1 oder 2 Basen verschiebt das Leseraster (Rasterschubmutation); das Hinzufügen oder Entfernen von 3 Basen fügt eine Aminosäure hinzu oder entfernt eine und behält das Raster. Die tRNA ist der Adapter: Ihre Anticodon-Schleife liest das Codon, und ihr 3′-Ende (CCA) trägt die Aminosäure. In 2D sieht sie wie ein Kleeblatt aus, in 3D wie ein umgekehrtes L.
Translation
- Beladen der tRNA (Aminoacylierung): Jede Aminosäure wird mit Hilfe von ATP an ihre tRNA gehängt.
- Initiation: Die kleine Ribosomen-Untereinheit trifft bei AUG auf die mRNA; die große Untereinheit schließt sich an. Das Ribosom hat zwei Plätze für tRNAs.
- Elongation: tRNAs bringen Codon für Codon Aminosäuren; Peptidbindungen entstehen (die 23S-rRNA wirkt als Enzym, ein Ribozym). Das Ribosom wandert in 5′→3′-Richtung weiter.
- Termination: An einem Stopp-Codon setzt ein Freisetzungsfaktor das Polypeptid frei.
Die mRNA hat auch untranslatierte Bereiche (UTRs) vor AUG und nach dem Stopp-Codon; sie helfen bei einer effizienten Translation.
Regulation der Genaktivität: das Lac-Operon
Zellen schalten Gene nur an, wenn sie gebraucht werden. Bei Bakterien liegen mehrere Gene für eine Aufgabe zusammen mit einem Promotor und einem Operator = ein Operon. Jacob und Monod beschrieben das Lac-Operon von E. coli:
- i-Gen: bildet das Repressor-Protein (immer aktiv).
- z-Gen: β-Galactosidase, spaltet Lactose in Glucose und Galactose.
- y-Gen: Permease, lässt Lactose in die Zelle.
- a-Gen: Transacetylase.
Keine Lactose: Der Repressor sitzt auf dem Operator und blockiert die RNA-Polymerase → Gene aus.
Lactose vorhanden: Lactose (der Induktor) bindet den Repressor, verändert seine Form, und er löst sich vom Operator → die RNA-Polymerase schreibt z, y, a ab → Enzyme werden gebildet. Das ist negative Regulation eines induzierbaren Operons. Wenn die Lactose aufgebraucht ist, bindet der Repressor wieder.
Humangenomprojekt und Reisgenom
Das Humangenomprojekt (HGP) lief von 1990 bis 2003 und las alle ~3 × 10⁹ bp der menschlichen DNA. Methoden: Expressed Sequence Tags (finden aktive Gene) und Sequenzannotation (erst alles lesen, dann Gene suchen). Die DNA wurde in Stücke geschnitten, in BAC-/YAC-Vektoren kloniert, mit automatischen Geräten sequenziert (Sanger-Methode) und mithilfe von Überlappungen per Computer zusammengesetzt.
Wichtige Ergebnisse
- Etwa 3164,7 Millionen bp; ein durchschnittliches Gen hat etwa 3000 Basen; das größte Gen, Dystrophin, hat 2,4 Millionen Basen.
- Etwa 30 000 Gene (viel weniger als gedacht); 99,9 % der Basen sind bei allen Menschen gleich.
- Weniger als 2 % des Genoms codieren Proteine; große Teile sind Wiederholungen.
- Chromosom 1 hat die meisten Gene (2968); das Y hat die wenigsten (231).
- Etwa 1,4 Millionen Stellen mit Unterschieden in einzelnen Basen (SNPs).
Weitere sequenzierte Organismen sind Reis, Bakterien, Hefe, Caenorhabditis elegans, die Fruchtfliege und Arabidopsis. Das Reisgenom hilft, Gene für Ertrag, Krankheitsresistenz und Stresstoleranz zu finden.
Genetischer Fingerabdruck
99,9 % der DNA sind bei allen Menschen gleich, also vergleicht man die 0,1 %, die sich unterscheiden, vor allem die repetitive DNA. Wenn DNA in der Dichtegradientenzentrifugation geschleudert wird, bilden Wiederholungen kleine Gipfel, die Satelliten-DNA heißen. Sie codieren keine Proteine und unterscheiden sich stark zwischen Menschen (Polymorphismus). Alec Jeffreys entwickelte die Methode mit VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats, also unterschiedlich viele aufeinanderfolgende Wiederholungen).
- DNA gewinnen (Blut, Haarwurzel, Speichel, Sperma).
- Mit Restriktionsenzymen schneiden.
- Die Fragmente per Gelelektrophorese trennen.
- Auf eine Nylon-/Nitrocellulose-Membran übertragen (Southern Blot).
- Eine markierte VNTR-Sonde zugeben, die an passenden Stücken haftet (Hybridisierung).
- Banden auf Röntgenfilm sichtbar machen (Autoradiografie).
Ein Kind bekommt die Hälfte seiner Banden von der Mutter und die Hälfte vom Vater. Anwendungen: Kriminalfälle, Vaterschaftstests, Studien zu Populationen und Evolution. Mit PCR lassen sich winzige Proben vorher vervielfältigen.
Wichtige Formeln und Definitionen
- Basenpaarung: A = T (2 H-Brücken), G ≡ C (3 H-Brücken)
- Chargaff: A = T, G = C, also A + G = C + T (Purine = Pyrimidine)
- Länge der DNA = Anzahl bp × 0,34 nm
- Eine Helixwindung = 10 bp = 3,4 nm
- Codons = 4³ = 64 (61 Sinn-Codons + 3 Stopp)
- Aminosäuren in einem Protein = (codierende Basen ÷ 3) − 1 Stopp-Codon
- Meselson–Stahl nach n Generationen in ¹⁴N: Hybridanteil = 2/2ⁿ, leicht = 1 − 2/2ⁿ
Gelöste Beispiele
1. Eine DNA-Probe hat 20 % Adenin. Bestimme den Anteil von T, G und C in %.
Schritt 1: A = T, also T = 20 %. Schritt 2: A + T = 40 %, also G + C = 60 %. Schritt 3: G = C = je 30 %.
2. Ein DNA-Molekül hat 1000 Basenpaare, davon 300 A–T-Paare. Wie viele Wasserstoffbrücken halten die beiden Stränge zusammen?
Schritt 1: G–C-Paare = 1000 − 300 = 700. Schritt 2: H-Brücken = 300 × 2 + 700 × 3 = 600 + 2100. Antwort: 2700 H-Brücken.
3. Bestimme die Länge eines DNA-Moleküls mit 5386 Basenpaaren (Größe des Phagen φX174).
Schritt 1: Länge = bp × 0,34 nm. Schritt 2: 5386 × 0,34 = 1831,24 nm. Antwort: etwa 1,83 µm.
4. Schreibe die mRNA, die vom Matrizenstrang 3′-TACGCAATG-5′ gebildet wird.
Schritt 1: Jede Base paaren: T→A, A→U, C→G, G→C. Schritt 2: mRNA 5′-AUGCGUUAC-3′. Schritt 3: Sie entspricht dem codierenden Strang 5′-ATGCGTTAC-3′ mit U statt T.
5. Eine mRNA lautet 5′-AUG UUU GGC AAA UGA-3′. Wie viele Aminosäuren hat das Protein, und welche?
Schritt 1: Codons lesen: AUG (Met), UUU (Phe), GGC (Gly), AAA (Lys), UGA (Stopp). Schritt 2: Das Stopp-Codon fügt keine Aminosäure hinzu. Antwort: 4 Aminosäuren: Met–Phe–Gly–Lys.
6. Ein Protein hat 300 Aminosäuren. Wie viele Basen hat der codierende Teil der mRNA mindestens (mit Stopp-Codon)?
Schritt 1: 300 Codons für Aminosäuren + 1 Stopp = 301 Codons. Schritt 2: 301 × 3 = 903 Basen.
7. E. coli mit DNA, die nur ¹⁵N enthält, wird in ¹⁴N-Medium umgesetzt. Welcher Anteil der DNA-Moleküle ist nach 3 Generationen ein Hybrid?
Schritt 1: Moleküle nach 3 Generationen = 2³ = 8 (aus einem). Schritt 2: Nur 2 behalten einen alten ¹⁵N-Strang → Hybrid. Schritt 3: 2/8 = 1/4 Hybrid, 6/8 = 3/4 leicht.
8. In der mRNA AUG CCU AAA UGA wird eine Base (C an Position 4) entfernt. Was passiert?
Schritt 1: Neue Sequenz AUG CUA AAU GA… Schritt 2: Die Codons ändern sich nach der Deletion: Met–Leu–Asn… Schritt 3: Das ist eine Rasterschubmutation: Alle späteren Aminosäuren ändern sich, und das Stopp-Codon kann verloren gehen.
Häufige Fehler
- Zu sagen, dass bei der Transkription der codierende Strang kopiert wird. Gelesen wird der Matrizenstrang; die RNA entspricht dem codierenden Strang (mit U).
- Ein Stopp-Codon als Aminosäure zu zählen. Stopp-Codons fügen nichts hinzu.
- Zu denken, der Repressor des Lac-Operons werde nur gebildet, wenn keine Lactose da ist. Das i-Gen ist immer aktiv; Lactose schaltet nur den Repressor ab.
- Die Chargaff-Regel für einsträngige DNA oder RNA zu benutzen. A = T und G = C gelten nur für Doppelstränge.