Il DNA come materiale genetico
Griffith (1928), trasformazione: batteri Streptococcus pneumoniae di tipo R, innocui e vivi, + batteri di tipo S letali uccisi dal calore → i topi morirono e si trovarono batteri S vivi. Qualcosa delle cellule S morte aveva «trasformato» R in S.
Avery, MacLeod e McCarty (1944): distrussero a una a una le parti dell'estratto S. Gli enzimi che digeriscono le proteine (proteasi) e la RNasi non fermarono la trasformazione; la DNasi sì. Quindi la sostanza trasformante era il DNA.
Hershey e Chase (1952): fecero crescere batteriofagi con ³²P radioattivo (finisce nel DNA) oppure ³⁵S (finisce nelle proteine). Dopo l'infezione e il frullatore, i batteri contenevano ³²P ma non ³⁵S. Quindi nella cellula entra il DNA, non la proteina, e porta le istruzioni.
Cosa rende buono un materiale genetico?
- Può copiarsi (replicarsi).
- È stabile chimicamente e nella struttura.
- Può cambiare lentamente (mutare) per permettere l'evoluzione.
- Può esprimersi come caratteri mendeliani.
L'RNA è meno stabile (il suo 2′-OH lo rende reattivo), quindi il DNA è migliore per conservare l'informazione; l'RNA è migliore per i lavori rapidi. Probabilmente l'RNA fu il primo materiale genetico (mondo a RNA).
Struttura di DNA e RNA
Un nucleotide = base azotata + zucchero pentoso + fosfato. Base + zucchero = nucleoside. Purine: adenina (A), guanina (G). Pirimidine: citosina (C), timina (T, solo nel DNA), uracile (U, solo nell'RNA). Lo zucchero del DNA è il desossiribosio; quello dell'RNA è il ribosio.
I nucleotidi si uniscono con legami fosfodiesterici 3′–5′. Watson e Crick (1953), usando le immagini a raggi X di Rosalind Franklin e Wilkins, proposero la doppia elica:
- Due filamenti, antiparalleli (5′→3′ e 3′→5′).
- A=T (2 legami H), G≡C (3 legami H). Una purina sta sempre di fronte a una pirimidina, quindi la larghezza resta di 2 nm.
- Spirale destrorsa, un giro = 3,4 nm = 10 coppie di basi, distanza tra le coppie 0,34 nm.
- Regola di Chargaff: A = T e G = C, quindi (A + G) = (C + T).
L'RNA di solito è a singolo filamento. Tipi: mRNA (messaggero), tRNA (adattatore), rRNA (parte del ribosoma).
Impacchettamento del DNA
Lunghezza del DNA = numero di coppie di basi × 0,34 nm. Cellula umana diploide: 6,6 × 10⁹ bp × 0,34 × 10⁻⁹ m ≈ 2,2 m, stipati in un nucleo largo circa 10⁻⁶ m.
- Procarioti: niente nucleo. Il DNA, carico negativamente, è tenuto da proteine con carica positiva in una zona chiamata nucleoide, in anse.
- Eucarioti: il DNA (negativo) si avvolge attorno agli istoni (positivi, ricchi di lisina e arginina). Otto istoni formano un ottamero di istoni; circa 200 bp di DNA lo avvolgono = un nucleosoma. I nucleosomi in fila sembrano «perle su un filo» → fibra di cromatina → ulteriore avvolgimento → cromosoma in metafase. Le proteine cromosomiche non istoniche (NHC) aiutano l'impacchettamento.
Eucromatina: poco compatta, chiara alla colorazione, attiva. Eterocromatina: molto compatta, scura alla colorazione, inattiva.
Replicazione del DNA (semiconservativa)
Watson e Crick previdero che ogni filamento fa da stampo. Meselson e Stahl (1958) lo dimostrarono: fecero crescere E. coli in ¹⁵N pesante, poi li spostarono in ¹⁴N normale. Dopo 1 generazione tutto il DNA era ibrido (¹⁵N–¹⁴N); dopo 2 generazioni metà ibrido e metà leggero. Taylor mostrò lo stesso nelle punte delle radici di fava usando timidina radioattiva.
Come avviene
- L'elicasi apre l'elica nell'origine di replicazione, formando una forcella di replicazione a forma di Y.
- La DNA polimerasi DNA-dipendente aggiunge nucleotidi solo nella direzione 5′→3′, usando i desossinucleosidi trifosfato (che forniscono sia il mattone sia l'energia).
- Su un filamento il nuovo DNA cresce senza interruzioni (filamento guida); sull'altro viene fatto a pezzetti (filamento ritardato, frammenti di Okazaki).
- La DNA ligasi unisce i pezzi.
È molto veloce (E. coli copia 4,6 × 10⁶ bp in circa 18 minuti, cioè circa 2000 bp al secondo) e molto precisa. Negli eucarioti avviene nella fase S.
Dogma centrale
Francis Crick propose che l'informazione genetica scorra DNA → RNA → proteina. DNA → DNA è la replicazione, DNA → RNA è la trascrizione, RNA → proteina è la traduzione.
La trascrizione inversa (RNA → DNA) avviene in alcuni virus come l'HIV, grazie alla trascrittasi inversa. Quindi il flusso a volte può andare all'indietro (dogma centrale inverso).
Trascrizione
Viene copiato un solo filamento. Il filamento stampo (3′→5′) viene letto; l'altro è il filamento codificante (5′→3′), che ha la stessa sequenza dell'RNA, con T al posto di U.
Un'unità di trascrizione ha un promotore (a monte, dove si lega l'RNA polimerasi), il gene strutturale e un terminatore.
Nei batteri
Un'unica RNA polimerasi fa tutti gli RNA. Con il fattore σ (sigma) comincia (inizio), allunga l'RNA (allungamento) e con il fattore ρ (rho) si ferma (terminazione). Trascrizione e traduzione possono avvenire insieme perché non c'è il nucleo.
Negli eucarioti
- RNA pol I → rRNA (28S, 18S, 5.8S); RNA pol II → hnRNA (precursore dell'mRNA); RNA pol III → tRNA, rRNA 5S, snRNA.
- I geni sono interrotti: esoni (espressi) e introni (intermedi). L'hnRNA viene elaborato: lo splicing toglie gli introni; il capping aggiunge metilguanosina trifosfato all'estremità 5′; la poliadenilazione aggiunge 200–300 adenine all'estremità 3′ (coda poli-A).
Codice genetico
George Gamow ragionò così: 4 basi devono codificare 20 amminoacidi. 4¹ = 4 e 4² = 16 sono troppo pochi; 4³ = 64 bastano. Quindi il codice è a triplette. Nirenberg, Khorana e Ochoa scoprirono i codoni.
- 64 codoni: 61 codificano amminoacidi, 3 sono codoni di stop (UAA, UAG, UGA).
- AUG = metionina ed è anche il codone di avvio (doppio ruolo).
- Non ambiguo e specifico: un codone → un amminoacido.
- Degenerato: molti amminoacidi hanno più di un codone.
- Letto senza virgole, in una cornice continua.
- Quasi universale: UUU = Phe nei batteri e nell'uomo (poche eccezioni nei mitocondri).
Mutazioni e codice
Una mutazione puntiforme (una base cambiata) può cambiare un amminoacido (anemia falciforme). L'inserzione o la delezione di 1 o 2 basi sposta la cornice di lettura (frameshift); aggiungere o togliere 3 basi aggiunge o toglie un amminoacido e mantiene la cornice. Il tRNA è l'adattatore: l'ansa dell'anticodone legge il codone e la sua estremità 3′ (CCA) porta l'amminoacido. In 2D sembra un trifoglio, in 3D una L capovolta.
Traduzione
- Carica del tRNA (amminoacilazione): ogni amminoacido viene attaccato al suo tRNA, usando ATP.
- Inizio: la subunità piccola del ribosoma incontra l'mRNA in AUG; si aggiunge la subunità grande. Il ribosoma ha due siti per i tRNA.
- Allungamento: i tRNA portano gli amminoacidi codone dopo codone; si formano legami peptidici (l'rRNA 23S fa da enzima, un ribozima). Il ribosoma avanza lungo l'mRNA in direzione 5′→3′.
- Terminazione: a un codone di stop, un fattore di rilascio libera il polipeptide.
L'mRNA ha anche regioni non tradotte (UTR) prima di AUG e dopo il codone di stop; aiutano a tradurre in modo efficiente.
Regolazione dell'espressione genica: l'operone lac
Le cellule accendono i geni solo quando servono. Nei batteri, diversi geni dello stesso compito stanno insieme con un solo promotore e un solo operatore = un operone. Jacob e Monod descrissero l'operone lac di E. coli:
- gene i: produce la proteina repressore (sempre attivo).
- gene z: β-galattosidasi, che spezza il lattosio in glucosio e galattosio.
- gene y: permeasi, che fa entrare il lattosio nella cellula.
- gene a: transacetilasi.
Senza lattosio: il repressore si siede sull'operatore e blocca l'RNA polimerasi → geni spenti.
Con lattosio: il lattosio (l'induttore) si lega al repressore, ne cambia la forma e lo fa staccare dall'operatore → l'RNA polimerasi trascrive z, y, a → si formano gli enzimi. Questa è la regolazione negativa di un operone inducibile. Quando il lattosio è finito, il repressore si lega di nuovo.
Progetto Genoma Umano e genoma del riso
Il Progetto Genoma Umano (HGP) si svolse dal 1990 al 2003 per leggere tutte le circa 3 × 10⁹ bp del DNA umano. Metodi: Expressed Sequence Tags (trovare i geni espressi) e annotazione di sequenza (leggere tutto, poi cercare i geni). Il DNA fu tagliato in pezzi, clonato in vettori BAC/YAC, sequenziato con macchine automatiche (metodo di Sanger) e ricomposto dai computer grazie alle sovrapposizioni.
Risultati principali
- Circa 3164,7 milioni di bp; un gene medio di circa 3000 basi; il gene più grande, la distrofina, ha 2,4 milioni di basi.
- Circa 30.000 geni (molti meno del previsto); il 99,9% delle basi è uguale in tutte le persone.
- Meno del 2% del genoma codifica proteine; ampie parti sono ripetizioni.
- Il cromosoma 1 ha più geni (2968); l'Y ne ha meno (231).
- Circa 1,4 milioni di punti con differenze di una sola base (SNP).
Tra gli altri organismi sequenziati ci sono il riso, batteri, lievito, Caenorhabditis elegans, il moscerino della frutta e Arabidopsis. Il genoma del riso aiuta a trovare i geni per la resa, la resistenza alle malattie e la tolleranza allo stress.
Impronta genetica (DNA fingerprinting)
Il 99,9% del DNA è uguale in tutti gli esseri umani, quindi si confronta lo 0,1% che differisce, soprattutto il DNA ripetitivo. Quando il DNA viene centrifugato in un gradiente di densità, le ripetizioni formano piccoli picchi chiamati DNA satellite. Non codificano proteine e variano molto da persona a persona (polimorfismo). Alec Jeffreys sviluppò il metodo usando i VNTR (Variable Number of Tandem Repeats, ripetizioni in tandem a numero variabile).
- Isolare il DNA (sangue, radice di un capello, saliva, sperma).
- Tagliarlo con enzimi di restrizione.
- Separare i frammenti con l'elettroforesi su gel.
- Trasferirli su una membrana di nylon/nitrocellulosa (Southern blotting).
- Aggiungere una sonda VNTR marcata che si attacca ai pezzi corrispondenti (ibridazione).
- Rivelare le bande su pellicola a raggi X (autoradiografia).
Un figlio riceve metà delle bande dalla madre e metà dal padre. Usi: casi forensi, test di paternità, studi di popolazione e di evoluzione. La PCR può moltiplicare prima campioni minuscoli.
Formule e definizioni chiave
- Appaiamento delle basi: A = T (2 legami H), G ≡ C (3 legami H)
- Chargaff: A = T, G = C, quindi A + G = C + T (purine = pirimidine)
- Lunghezza del DNA = numero di bp × 0.34 nm
- Un giro di elica = 10 bp = 3.4 nm
- Codoni = 4³ = 64 (61 senso + 3 stop)
- Amminoacidi in una proteina = (basi codificanti ÷ 3) − 1 codone di stop
- Meselson–Stahl dopo n generazioni in ¹⁴N: frazione ibrida = 2/2ⁿ, leggera = 1 − 2/2ⁿ
Esempi svolti
1. Un campione di DNA ha il 20% di adenina. Trova la % di T, G e C.
Passo 1: A = T, quindi T = 20%. Passo 2: A + T = 40%, quindi G + C = 60%. Passo 3: G = C = 30% ciascuna.
2. Una molecola di DNA ha 1000 coppie di basi, di cui 300 sono coppie A–T. Quanti legami a idrogeno tengono insieme i due filamenti?
Passo 1: coppie G–C = 1000 − 300 = 700. Passo 2: legami H = 300 × 2 + 700 × 3 = 600 + 2100. Risposta: 2700 legami H.
3. Trova la lunghezza di una molecola di DNA con 5386 coppie di basi (la dimensione del fago φX174).
Passo 1: lunghezza = bp × 0.34 nm. Passo 2: 5386 × 0.34 = 1831.24 nm. Risposta: circa 1.83 µm.
4. Scrivi l'mRNA prodotto dal filamento stampo 3′-TACGCAATG-5′.
Passo 1: appaia ogni base: T→A, A→U, C→G, G→C. Passo 2: mRNA 5′-AUGCGUUAC-3′. Passo 3: è uguale al filamento codificante 5′-ATGCGTTAC-3′ con U al posto di T.
5. Un mRNA si legge 5′-AUG UUU GGC AAA UGA-3′. Quanti amminoacidi avrà la proteina, e quali?
Passo 1: leggi i codoni: AUG (Met), UUU (Phe), GGC (Gly), AAA (Lys), UGA (stop). Passo 2: lo stop non aggiunge amminoacidi. Risposta: 4 amminoacidi: Met–Phe–Gly–Lys.
6. Una proteina ha 300 amminoacidi. Qual è il numero minimo di basi della sua parte codificante di mRNA (con il codone di stop)?
Passo 1: 300 codoni per gli amminoacidi + 1 stop = 301 codoni. Passo 2: 301 × 3 = 903 basi.
7. E. coli con DNA solo ¹⁵N viene spostato in terreno ¹⁴N. Dopo 3 generazioni, quale frazione delle molecole di DNA è ibrida?
Passo 1: molecole dopo 3 generazioni = 2³ = 8 (partendo da una). Passo 2: solo 2 conservano un filamento ¹⁵N vecchio → ibride. Passo 3: 2/8 = 1/4 ibride, 6/8 = 3/4 leggere.
8. Nell'mRNA AUG CCU AAA UGA viene eliminata una base (la C in posizione 4). Che cosa succede?
Passo 1: nuova sequenza AUG CUA AAU GA… Passo 2: i codoni cambiano dopo la delezione: Met–Leu–Asn… Passo 3: è una mutazione frameshift: tutti gli amminoacidi successivi cambiano e il codone di stop può andare perso.
Errori comuni
- Dire che durante la trascrizione viene copiato il filamento codificante. Si legge il filamento stampo; l'RNA somiglia al filamento codificante (con U).
- Contare un codone di stop come amminoacido. I codoni di stop non aggiungono nulla.
- Pensare che il repressore dell'operone lac si formi solo quando manca il lattosio. Il gene i è sempre attivo; il lattosio si limita a spegnere il repressore.
- Usare la regola di Chargaff per DNA a singolo filamento o per l'RNA. A = T e G = C valgono solo per i filamenti doppi.