Was sind Biotechnologie und Gentechnik?
Biotechnologie heißt, Lebewesen oder ihre Teile (Zellen, Enzyme) zu nutzen, um nützliche Produkte herzustellen. Joghurt aus Milch zu machen ist alte Biotechnologie. Die moderne Biotechnologie beruht auf zwei Ideen:
- Gentechnik: Das Erbmaterial (DNA oder RNA) eines Lebewesens wird verändert, sodass sich sein Phänotyp ändert.
- Keimfrei arbeiten (aseptische Bedingungen): Es soll nur der gewünschte Mikroorganismus oder die gewünschte Zelle wachsen, keine Keime von außen.
Warum nicht einfach normal züchten? Bei der Züchtung werden tausende Gene auf einmal gemischt, auch unerwünschte. Die Gentechnik überträgt nur das eine Gen, das wir wollen. Die erste rekombinante DNA stellten 1972 Stanley Cohen und Herbert Boyer her: Sie bauten ein Antibiotika-Resistenzgen in ein Plasmid von Salmonella typhimurium ein.
Warum braucht man einen Vektor? Ein DNA-Stück, das allein in eine Zelle kommt, kann sich meist nicht selbst kopieren. Es muss sich an eine DNA mit Replikationsursprung (ori) binden, der Stelle, an der das Kopieren beginnt. Ein Plasmid hat einen ori, deshalb wird das Gen mitkopiert.
Werkzeuge der rekombinanten DNA-Technik
1. Restriktionsenzyme (molekulare Scheren)
Diese Enzyme schneiden die DNA an einer festen Abfolge, der Erkennungssequenz. Die ersten wurden in Bakterien gefunden, wo sie die DNA angreifender Viren zerschneiden. Sie gehören zu einer größeren Gruppe, den Nukleasen: Exonukleasen entfernen Buchstaben an den Enden; Endonukleasen schneiden mitten in der DNA. Restriktionsenzyme sind Endonukleasen. Die Erkennungssequenz ist ein Palindrom: In Richtung 5′→3′ gelesen ist sie auf beiden Strängen gleich. Beispiel EcoRI-Stelle: 5′-GAATTC-3′, auf dem anderen Strang 3′-CTTAAG-5′ (rückwärts gelesen = GAATTC). Viele Enzyme schneiden etwas neben der Mitte und hinterlassen klebrige Enden, die leicht mit jeder DNA paaren, die vom selben Enzym geschnitten wurde.
Namensregel: EcoRI = E (Gattung Escherichia) + co (Art coli) + R (Stamm RY13) + I (erstes Enzym, das in diesem Stamm gefunden wurde). Man kennt mehr als 900 Restriktionsenzyme. (Hind II war das erste, gefunden in den 1970er Jahren; es schneidet ebenfalls an einer Stelle mit 6 Buchstaben.)
2. DNA-Ligase (molekularer Kleber)
Sie verbindet das Zucker-Phosphat-Rückgrat von Gen und Vektor.
3. Klonierungsvektoren
Plasmide und Bakteriophagen. Ein guter Vektor braucht:
- ori: startet das Kopieren und bestimmt die Kopienzahl.
- Selektionsmarker: ein Gen (z. B. Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin), mit dem wir transformierte Zellen auswählen und die übrigen abtöten.
- Klonierungsstellen: am besten nur eine Schnittstelle pro Enzym, damit der Vektor nicht in viele Stücke zerschnitten wird.
- Geringe Größe, damit er leicht in Zellen gelangt.
pBR322 ist ein häufiges E.-coli-Plasmid mit ori, rop, ampR und tetR und Schnittstellen wie BamHI und PstI. Wenn wir ein Gen in tetR einsetzen, funktioniert tetR nicht mehr (Insertionsinaktivierung): Rekombinante Zellen wachsen auf Ampicillin, sterben aber auf Tetracyclin. Ein einfacherer Test ist die Blau-Weiß-Selektion: Das Gen wird in das lacZ-Gen für β-Galactosidase eingesetzt. Kolonien mit Insert können das Enzym nicht herstellen und bleiben weiß; Kolonien ohne Insert werden auf einer chromogenen Platte blau.
Vektoren für Pflanzen: das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens (entschärft, sodass es keine Tumoren mehr auslöst). Für Tiere: entschärfte Retroviren.
4. Kompetenter Wirt
DNA ist wasserliebend und kommt schlecht durch die Zellmembran. Wir machen Zellen kompetent: Bakterien mit Calciumchlorid behandeln, auf Eis kühlen, kurz auf 42 °C erhitzen (Hitzeschock), dann wieder auf Eis. Andere Wege: Mikroinjektion (in den Zellkern einer Tierzelle), Genkanone / Biolistik (Pflanzenzellen werden mit DNA-beschichteten Gold- oder Wolframkügelchen beschossen) und entschärfte Krankheitserreger als Überträger.
Die Schritte der rekombinanten DNA-Technik
- DNA isolieren: Die Zelle mit Enzymen öffnen (Lysozym bei Bakterien, Cellulase bei Pflanzen, Chitinase bei Pilzen). RNA mit Ribonuklease und Proteine mit Protease entfernen. Eiskalter Ethanol zugeben: Reine DNA erscheint als weiße Fäden (Spooling).
- DNA schneiden mit einem Restriktionsenzym bei fester Temperatur. Den Schnitt mit Gelelektrophorese prüfen.
- Viele Kopien mit PCR (Polymerase-Kettenreaktion): zwei kurze Primer + Taq-Polymerase (hitzestabil, aus dem Bakterium Thermus aquaticus). Jeder Zyklus = Denaturierung (~94 °C), Anlagerung der Primer (~50–60 °C), Verlängerung (~72 °C). Nach n Zyklen wird aus 1 DNA → 2ⁿ Kopien.
- Das Gen in den Vektor ligieren (auf beiden dasselbe Enzym) mit DNA-Ligase → rekombinante DNA.
- In einen Wirt einbringen (Transformation) und die transformierten Zellen mit dem Marker auswählen.
- Das Genprodukt gewinnen: Das Protein, das vom fremden Gen gebildet wird, ist ein rekombinantes Protein. Für große Mengen wachsen die Zellen in Bioreaktoren (Tanks mit 100–1000 Litern), die Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff, Nährstoffe und Schaum regeln. Der Rührkessel-Bioreaktor hat einen Rührer und einen Sparger (zum Einblasen von Luft).
- Aufarbeitung (Downstream Processing): das Produkt abtrennen und reinigen, Konservierungsmittel zugeben, testen (klinische Studien bei Medikamenten) und verpacken.
Gelelektrophorese
DNA ist negativ geladen. In einem Agarosegel (aus Algen) wandert DNA im elektrischen Feld zur Anode (+). Das Gel wirkt wie ein Sieb: Kleinere Stücke wandern weiter. Mit Ethidiumbromid anfärben, dann sieht man im UV-Licht orange Banden. Die Bande ausschneiden und die DNA herauslösen (Elution).
Zu Hause ausprobieren: DNA sichtbar machen
Zerdrücke eine reife Banane oder einige grüne Erbsen mit einer Prise Salz und einem Löffel Spülmittel in einer halben Tasse warmem Wasser. Filtere die Masse durch ein Teesieb. Gieße langsam eiskalten Reinigungsalkohol (frag einen Erwachsenen) am Rand des Glases entlang ein. Oben erscheinen weiße Fäden: Das ist DNA, genau wie beim Spooling-Schritt. Verändere im 3D die PCR-Zyklen und sage die Kopienzahl vorher, bevor du nachschaust.
Prüfungstipp: Dieses Kapitel bringt etwa 12 Punkte. Häufige Fragen: Merkmale eines Vektors, Beschriftung des pBR322-Plasmids, warum dasselbe Enzym für Vektor und Gen, Schritte der PCR, Prinzip der Gelelektrophorese, Insertionsinaktivierung.
Wichtige Formeln und Definitionen
- Gentechnik = schneiden (Restriktionsenzym) + kleben (Ligase) + tragen (Vektor) + kopieren (PCR)
- EcoRI-Stelle: 5′-G↓AATTC-3′ (Palindrom, klebrige Enden AATT)
- PCR: Kopien nach n Zyklen = 2ⁿ × Anfangskopien
- PCR-Zyklus: denaturieren ~94°C → anlagern ~55°C → verlängern ~72°C (Taq-Polymerase)
- Vektor braucht: ori + Selektionsmarker + einzelne Klonierungsstelle + geringe Größe
- Gelelektrophorese: DNA (−) wandert zur Anode (+); kleiner = weiter
- Blaue Kolonie = kein Insert; weiße Kolonie = rekombinant (lacZ inaktiviert)
Gelöste Beispiele
1. Du startest die PCR mit 1 DNA-Molekül. Wie viele Kopien gibt es nach 5 Zyklen?
Jeder Zyklus verdoppelt. Kopien = 2ⁿ = 2⁵ = 32 Kopien.
2. Du startest mit 10 DNA-Molekülen und machst 10 Zyklen. Wie viele Kopien entstehen?
Kopien = 10 × 2¹⁰ = 10 × 1024 = 10,240 Kopien.
3. Wie viele PCR-Zyklen braucht man, um aus 1 Molekül mindestens 1000 Kopien zu erhalten?
2⁹ = 512 (zu wenig), 2¹⁰ = 1024 (genug). Also 10 Zyklen.
4. Ein PCR-Zyklus dauert 3 Minuten. Wie lange dauern 20 Zyklen, und wie viele Kopien entstehen aus einem Molekül?
Zeit = 20 × 3 = 60 min = 1 Stunde. Kopien = 2²⁰ = 1,048,576, also etwa eine Million.
5. Eine Erkennungsstelle mit 6 Buchstaben kommt im Mittel einmal alle 4⁶ Buchstaben vor. Wie oft ist das? Wie viele Schnitte gibt es ungefähr in einer DNA von 40,960 Basenpaaren?
4⁶ = 4096. Also etwa eine Stelle alle 4096 bp. Schnitte ≈ 40,960 ÷ 4096 = 10 Schnitte (im Mittel).
6. Ein ringförmiges Plasmid hat 3 Schnittstellen für BamHI. Wie viele Stücke entstehen nach dem Schnitt mit BamHI? Und bei einer geraden (linearen) DNA mit 3 Schnittstellen?
Ein Ring, der an 3 Stellen geschnitten wird, ergibt 3 Stücke. Eine gerade Linie mit 3 Schnitten ergibt 3 + 1 = 4 Stücke. Deshalb sollte ein Vektor nur eine Schnittstelle pro Enzym haben.
7. Ein Gen wird in die BamHI-Stelle innerhalb von tetR in pBR322 eingesetzt. Auf welchen Platten wachsen die rekombinanten Zellen?
tetR ist zerstört (Insertionsinaktivierung), ampR funktioniert noch. Also wachsen rekombinante Zellen auf Ampicillin, aber NICHT auf Tetracyclin. Zellen mit dem unveränderten Plasmid wachsen auf beiden.
8. Drei DNA-Stücke mit 500 bp, 2000 bp und 5000 bp werden auf einem Gel aufgetrennt. Welches liegt am nächsten an den Taschen?
Größere Stücke wandern weniger durch das Sieb. Also bleibt 5000 bp am nächsten an den Taschen; 500 bp wandert am weitesten zur Anode.
Häufige Fehler
- Zu sagen, DNA wandere bei der Gelelektrophorese zur Kathode. DNA ist negativ, also wandert sie zur Anode (+).
- Für Gen und Vektor verschiedene Restriktionsenzyme zu benutzen und zu erwarten, dass die klebrigen Enden passen. Nimm dasselbe Enzym.
- Zu denken, eine blaue Kolonie sei rekombinant. Blau heißt, lacZ funktioniert noch, also gibt es KEIN Insert; weiß ist rekombinant.
- Zu schreiben, Restriktionsenzyme seien Exonukleasen. Sie schneiden mitten in der DNA, also sind sie Endonukleasen.