¿Qué son la biotecnología y la ingeniería genética?
La biotecnología consiste en usar seres vivos o sus partes (células, enzimas) para fabricar productos útiles. Hacer yogur con leche es biotecnología antigua. La biotecnología moderna se apoya en dos ideas:
- Ingeniería genética: cambiar el material genético (ADN o ARN) de un ser vivo, de modo que cambie su fenotipo.
- Mantener todo estéril (condiciones asépticas): para que crezca solo el microbio o la célula que queremos, y no los gérmenes de fuera.
¿Por qué no usar el cruce normal? Al cruzar se mezclan miles de genes a la vez, también los que no queremos. La ingeniería genética mueve solo el gen que nos interesa. El primer ADN recombinante lo hicieron en 1972 Stanley Cohen y Herbert Boyer: unieron un gen de resistencia a un antibiótico a un plásmido de Salmonella typhimurium.
¿Por qué hace falta un vector? Un trozo de ADN que entra solo en una célula normalmente no puede copiarse. Tiene que unirse a un ADN con un origen de replicación (ori), el lugar donde empieza la copia. Un plásmido tiene ori, así que el gen se copia junto con él.
Herramientas de la tecnología del ADN recombinante
1. Enzimas de restricción (tijeras moleculares)
Estas enzimas cortan el ADN en una secuencia fija llamada sitio de reconocimiento. Las primeras se encontraron en bacterias, donde cortan el ADN de los virus que las atacan. Pertenecen a un grupo más grande, las nucleasas: las exonucleasas quitan letras de los extremos; las endonucleasas cortan por dentro del ADN. Las enzimas de restricción son endonucleasas. El sitio de reconocimiento es un palíndromo: leído de 5′→3′ es igual en las dos hebras. Ejemplo, sitio de EcoRI: 5′-GAATTC-3′ y en la otra hebra 3′-CTTAAG-5′ (leído al revés = GAATTC). Muchas enzimas cortan un poco lejos del centro y dejan extremos cohesivos que se unen fácilmente con cualquier ADN cortado por la misma enzima.
Regla del nombre: EcoRI = E (género Escherichia) + co (especie coli) + R (cepa RY13) + I (primera enzima hallada en esa cepa). Se conocen más de 900 enzimas de restricción. (Hind II fue la primera, hallada en los años 70; también corta en un sitio de 6 letras.)
2. ADN ligasa (pegamento molecular)
Une el esqueleto de azúcar y fosfato del gen y del vector.
3. Vectores de clonación
Plásmidos y bacteriófagos. Un buen vector necesita:
- ori: empieza la copia y decide el número de copias.
- Marcador de selección: un gen (por ejemplo de resistencia a ampicilina, tetraciclina o kanamicina) que nos deja elegir las células transformadas y matar las demás.
- Sitios de clonación: lo ideal es un solo sitio para cada enzima, para que el vector no se corte en muchos trozos.
- Tamaño pequeño para entrar fácilmente en las células.
pBR322 es un plásmido común de E. coli con ori, rop, y los genes ampR y tetR, y sitios como BamHI y PstI. Si insertamos un gen dentro de tetR, ese gen deja de funcionar (inactivación por inserción): las células recombinantes crecen con ampicilina pero mueren con tetraciclina. Una prueba más sencilla es el método azul-blanco: el gen se inserta dentro del gen lacZ de la β-galactosidasa. Las colonias con inserto no pueden fabricar la enzima y quedan blancas; las que no tienen inserto se ponen azules en una placa con sustrato cromogénico.
Vectores para plantas: el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (desarmado para que ya no cause tumores). Para animales: retrovirus desarmados.
4. Huésped competente
El ADN es hidrófilo (le gusta el agua) y no atraviesa fácilmente la membrana de la célula. Hacemos las células competentes: tratamos las bacterias con cloruro de calcio, las enfriamos en hielo, las calentamos un momento a 42 °C (choque térmico) y las volvemos a poner en hielo. Otras formas: la microinyección (en el núcleo de una célula animal), la pistola de genes o biolística (se disparan a células vegetales bolitas de oro o tungsteno cubiertas de ADN) y los patógenos desarmados como transportadores.
Pasos de la tecnología del ADN recombinante
- Aislar el ADN: romper la célula con enzimas (lisozima para bacterias, celulasa para plantas, quitinasa para hongos). Quitar el ARN con ribonucleasa y las proteínas con proteasa. Añadir etanol frío: el ADN puro sale como hilos blancos (ovillado).
- Cortar el ADN con una enzima de restricción a temperatura fija. Comprobar el corte con electroforesis en gel.
- Hacer muchas copias con PCR (reacción en cadena de la polimerasa): dos cebadores cortos + Taq polimerasa (resistente al calor, de la bacteria Thermus aquaticus). Cada ciclo = desnaturalización (~94 °C), hibridación de los cebadores (~50–60 °C), extensión (~72 °C). Después de n ciclos, 1 ADN → 2ⁿ copias.
- Ligar el gen al vector (misma enzima en ambos) con ADN ligasa → ADN recombinante.
- Meterlo en un huésped (transformación) y elegir las células transformadas con el marcador.
- Obtener el producto del gen extraño: la proteína que fabrica el gen extraño es una proteína recombinante. Para obtener mucha, las células crecen en biorreactores (tanques de 100–1000 litros) que controlan temperatura, pH, oxígeno, nutrientes y espuma. El biorreactor de tanque agitado tiene un agitador y un difusor (para burbujear aire).
- Procesamiento posterior: separar y purificar el producto, añadir conservantes, hacer pruebas (ensayos clínicos si es un medicamento) y envasar.
Electroforesis en gel
El ADN tiene carga negativa. En un gel de agarosa (hecho de algas) con un campo eléctrico, el ADN se mueve hacia el ánodo (+). El gel funciona como un tamiz: los trozos más pequeños llegan más lejos. Se tiñe con bromuro de etidio y se ven bandas naranjas con luz UV. Se corta la banda y se saca el ADN (elución).
Pruébalo en casa: saca ADN
Tritura un plátano maduro o unos guisantes con una pizca de sal y una cucharada de jabón lavavajillas en media taza de agua tibia. Filtra con un colador de té. Echa despacio alcohol isopropílico muy frío (pide ayuda a un adulto) por la pared del vaso. Arriba aparecen hilos blancos: es ADN, igual que en el paso del ovillado. En el 3D, mueve los ciclos de PCR y adivina las copias antes de mirar.
Consejo para el examen: esta unidad suele valer unos 12 puntos. Preguntas habituales: características de un vector, partes del esquema de pBR322, por qué la misma enzima para vector y gen, pasos de la PCR, principio de la electroforesis en gel, inactivación por inserción.
Fórmulas y definiciones clave
- Ingeniería genética = cortar (enzima de restricción) + pegar (ligasa) + llevar (vector) + copiar (PCR)
- Sitio de EcoRI: 5′-G↓AATTC-3′ (palíndromo, extremos cohesivos AATT)
- PCR: copias tras n ciclos = 2ⁿ × copias iniciales
- Ciclo de PCR: desnaturalizar ~94°C → hibridar ~55°C → extender ~72°C (Taq polimerasa)
- El vector necesita: ori + marcador de selección + un solo sitio de clonación + tamaño pequeño
- Electroforesis en gel: el ADN (−) va al ánodo (+); más pequeño = más lejos
- Colonia azul = sin inserto; colonia blanca = recombinante (lacZ inactivado)
Ejemplos resueltos
1. Empiezas una PCR con 1 molécula de ADN. ¿Cuántas copias hay tras 5 ciclos?
Cada ciclo duplica. Copias = 2ⁿ = 2⁵ = 32 copias.
2. Empiezas con 10 moléculas de ADN y haces 10 ciclos. ¿Cuántas copias hay?
Copias = 10 × 2¹⁰ = 10 × 1024 = 10,240 copias.
3. ¿Cuántos ciclos de PCR hacen falta para tener al menos 1000 copias a partir de 1 molécula?
2⁹ = 512 (pocas), 2¹⁰ = 1024 (suficiente). Entonces, 10 ciclos.
4. Un ciclo de PCR dura 3 minutos. ¿Cuánto tardan 20 ciclos y cuántas copias salen de una molécula?
Tiempo = 20 × 3 = 60 min = 1 hora. Copias = 2²⁰ = 1,048,576, casi un millón.
5. Un sitio de reconocimiento de 6 letras aparece, de media, una vez cada 4⁶ letras. ¿Cada cuánto es eso? ¿Más o menos cuántos cortes habrá en un ADN de 40,960 pares de bases?
4⁶ = 4096. Así que hay un sitio cada 4096 pb, aproximadamente. Cortes ≈ 40,960 ÷ 4096 = 10 cortes (de media).
6. Un plásmido circular tiene 3 sitios para BamHI. ¿Cuántos trozos salen al cortarlo con BamHI? ¿Y con un ADN recto (lineal) con 3 sitios?
Un círculo cortado en 3 puntos da 3 trozos. Una línea recta cortada en 3 puntos da 3 + 1 = 4 trozos. Por eso un vector debe tener un solo sitio para cada enzima.
7. Se inserta un gen en el sitio BamHI dentro de tetR de pBR322. ¿En qué placas crecen las células recombinantes?
tetR queda roto (inactivación por inserción) y ampR sigue funcionando. Así que las células recombinantes crecen con ampicilina pero NO con tetraciclina. Las células con el plásmido sin inserto crecen en ambas.
8. Se corren en un gel tres trozos de ADN de 500 pb, 2000 pb y 5000 pb. ¿Cuál queda más cerca de los pocillos?
Los trozos grandes se mueven menos por el tamiz. Así que el de 5000 pb queda más cerca de los pocillos; el de 500 pb llega más lejos hacia el ánodo.
Errores comunes
- Decir que el ADN va al cátodo en la electroforesis en gel. El ADN es negativo, así que va al ánodo (+).
- Usar enzimas de restricción distintas para el gen y el vector y esperar que los extremos cohesivos encajen. Hay que usar la misma enzima.
- Pensar que una colonia azul es recombinante. Azul significa que lacZ aún funciona, así que NO hay inserto; blanca es recombinante.
- Escribir que las enzimas de restricción son exonucleasas. Cortan por dentro del ADN, así que son endonucleasas.