Qu'est-ce que la biotechnologie et le génie génétique ?
La biotechnologie consiste à utiliser des êtres vivants ou leurs parties (cellules, enzymes) pour fabriquer des produits utiles. Faire du yaourt à partir de lait est de la biotechnologie ancienne. La biotechnologie moderne repose sur deux idées :
- Le génie génétique : modifier le matériel génétique (ADN ou ARN) d'un être vivant pour changer son phénotype.
- Garder les conditions stériles (conditions aseptiques) : pour que seuls le microbe ou la cellule voulus se développent, et pas les germes venus de l'extérieur.
Pourquoi ne pas simplement utiliser la reproduction classique ? Le croisement mélange des milliers de gènes à la fois, y compris des gènes non voulus. Le génie génétique ne déplace que le seul gène souhaité. Le premier ADN recombinant a été fabriqué en 1972 par Stanley Cohen et Herbert Boyer : ils ont inséré un gène de résistance à un antibiotique dans un plasmide de Salmonella typhimurium.
Pourquoi faut-il un vecteur ? Un morceau d'ADN introduit seul dans une cellule ne peut généralement pas se copier. Il doit s'attacher à un ADN qui possède une origine de réplication (ori), l'endroit où la copie commence. Un plasmide a une ori, donc le gène est copié avec lui.
Les outils de la technologie de l'ADN recombinant
1. Les enzymes de restriction (ciseaux moléculaires)
Ces enzymes coupent l'ADN à une séquence fixe appelée site de reconnaissance. Les premières ont été trouvées chez des bactéries, où elles coupent l'ADN des virus qui attaquent. Elles font partie d'un groupe plus large, les nucléases : les exonucléases retirent des lettres aux extrémités ; les endonucléases coupent à l'intérieur de l'ADN. Les enzymes de restriction sont des endonucléases. Le site de reconnaissance est un palindrome : lu de 5′ vers 3′, il est identique sur les deux brins. Exemple, le site EcoRI : 5′-GAATTC-3′ et sur l'autre brin 3′-CTTAAG-5′ (lu à l'envers = GAATTC). Beaucoup d'enzymes coupent un peu à côté du centre et laissent des extrémités cohésives qui s'apparient facilement avec tout ADN coupé par la même enzyme.
Règle de nom : EcoRI = E (genre Escherichia) + co (espèce coli) + R (souche RY13) + I (première enzyme trouvée dans cette souche). Plus de 900 enzymes de restriction sont connues. (Hind II a été la première, découverte dans les années 1970 ; elle coupe aussi à un site de 6 lettres.)
2. L'ADN ligase (colle moléculaire)
Elle relie le squelette sucre-phosphate du gène et du vecteur.
3. Les vecteurs de clonage
Les plasmides et les bactériophages. Un bon vecteur doit avoir :
- ori : démarre la copie et fixe le nombre de copies.
- Un marqueur de sélection : un gène (par exemple de résistance à l'ampicilline, à la tétracycline, à la kanamycine) qui permet de choisir les cellules transformées et de tuer les autres.
- Des sites de clonage : idéalement un seul site pour chaque enzyme, pour que le vecteur ne soit pas coupé en plusieurs morceaux.
- Une petite taille pour entrer facilement dans les cellules.
pBR322 est un plasmide courant d'E. coli avec ori, rop, les gènes ampR et tetR et des sites comme BamHI et PstI. Si on insère un gène dans tetR, ce gène ne fonctionne plus (inactivation par insertion) : les cellules recombinantes poussent sur ampicilline mais meurent sur tétracycline. Un test plus simple est la méthode bleu-blanc : le gène est inséré dans le gène lacZ de la β-galactosidase. Les colonies avec un insert ne peuvent pas fabriquer l'enzyme et restent blanches ; celles sans insert deviennent bleues sur une boîte à substrat chromogène.
Vecteurs pour les plantes : le plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (désarmé pour qu'il ne provoque plus de tumeurs). Pour les animaux : des rétrovirus désarmés.
4. L'hôte compétent
L'ADN aime l'eau et passe difficilement la membrane de la cellule. On rend les cellules compétentes : on traite les bactéries au chlorure de calcium, on les refroidit sur la glace, on les chauffe brièvement à 42 °C (choc thermique), puis on les remet sur la glace. Autres méthodes : la micro-injection (dans le noyau d'une cellule animale), le canon à gènes / biolistique (des billes d'or ou de tungstène couvertes d'ADN sont tirées sur des cellules végétales), et des agents pathogènes désarmés comme porteurs.
Les étapes de la technologie de l'ADN recombinant
- Isoler l'ADN : casser la cellule avec des enzymes (lysozyme pour les bactéries, cellulase pour les plantes, chitinase pour les champignons). Retirer l'ARN avec la ribonucléase et les protéines avec la protéase. Ajouter de l'éthanol glacé : l'ADN pur apparaît en filaments blancs (bobinage).
- Couper l'ADN avec une enzyme de restriction à température fixe. Vérifier la coupure par électrophorèse sur gel.
- Faire beaucoup de copies par PCR (réaction en chaîne par polymérase) : deux courtes amorces + Taq polymérase (résistante à la chaleur, issue de la bactérie Thermus aquaticus). Chaque cycle = dénaturation (~94 °C), hybridation des amorces (~50–60 °C), élongation (~72 °C). Après n cycles, 1 ADN → 2ⁿ copies.
- Ligaturer le gène dans le vecteur (même enzyme des deux côtés) avec l'ADN ligase → ADN recombinant.
- Insérer dans un hôte (transformation) et sélectionner les cellules transformées avec le marqueur.
- Obtenir le produit du gène étranger : la protéine fabriquée par le gène étranger est une protéine recombinante. Pour en avoir beaucoup, les cellules poussent dans des bioréacteurs (cuves de 100 à 1000 litres) qui contrôlent la température, le pH, l'oxygène, les nutriments et la mousse. Le bioréacteur à cuve agitée a un agitateur et un diffuseur (pour faire buller l'air).
- Traitement en aval : séparer et purifier le produit, ajouter des conservateurs, tester (essais cliniques pour les médicaments) et conditionner.
Électrophorèse sur gel
L'ADN est chargé négativement. Dans un gel d'agarose (issu d'algues) soumis à un champ électrique, l'ADN se déplace vers l'anode (+). Le gel joue le rôle de tamis : les petits morceaux avancent plus loin. On colore au bromure d'éthidium et on voit des bandes orange sous lumière UV. On découpe la bande et on récupère l'ADN (élution).
À essayer chez toi : extraire de l'ADN
Écrase une banane bien mûre ou quelques petits pois avec une pincée de sel et une cuillère de liquide vaisselle dans une demi-tasse d'eau tiède. Filtre avec une passoire à thé. Verse lentement de l'alcool à friction très froid (demande à un adulte) le long du verre. Des filaments blancs apparaissent en haut : c'est de l'ADN, comme dans l'étape de bobinage. Dans la 3D, fais glisser les cycles de PCR et devine le nombre de copies avant de regarder.
Conseil pour l'examen : cette unité vaut environ 12 points. Questions fréquentes : caractéristiques d'un vecteur, légendes du schéma de pBR322, pourquoi la même enzyme pour le vecteur et le gène, étapes de la PCR, principe de l'électrophorèse sur gel, inactivation par insertion.
Formules et définitions clés
- Génie génétique = couper (enzyme de restriction) + coller (ligase) + porter (vecteur) + copier (PCR)
- Site EcoRI : 5′-G↓AATTC-3′ (palindrome, extrémités cohésives AATT)
- PCR : copies après n cycles = 2ⁿ × copies de départ
- Cycle de PCR : dénaturation ~94°C → hybridation ~55°C → élongation ~72°C (Taq polymérase)
- Un vecteur a besoin de : ori + marqueur de sélection + un seul site de clonage + petite taille
- Électrophorèse sur gel : l'ADN (−) va vers l'anode (+) ; plus petit = plus loin
- Colonie bleue = pas d'insert ; colonie blanche = recombinante (lacZ inactivé)
Exemples résolus
1. Tu démarres une PCR avec 1 molécule d'ADN. Combien de copies après 5 cycles ?
Chaque cycle double le nombre. Copies = 2ⁿ = 2⁵ = 32 copies.
2. Tu démarres avec 10 molécules d'ADN et tu fais 10 cycles. Combien de copies ?
Copies = 10 × 2¹⁰ = 10 × 1024 = 10,240 copies.
3. Combien de cycles de PCR faut-il pour obtenir au moins 1000 copies à partir d'une molécule ?
2⁹ = 512 (trop peu), 2¹⁰ = 1024 (suffisant). Donc 10 cycles.
4. Un cycle de PCR dure 3 minutes. Combien de temps pour 20 cycles, et combien de copies à partir d'une molécule ?
Temps = 20 × 3 = 60 min = 1 heure. Copies = 2²⁰ = 1,048,576, soit environ un million.
5. Un site de reconnaissance de 6 lettres apparaît en moyenne une fois toutes les 4⁶ lettres. À quelle fréquence ? Environ combien de coupures dans un ADN de 40,960 paires de bases ?
4⁶ = 4096. Donc environ un site tous les 4096 pb. Coupures ≈ 40,960 ÷ 4096 = 10 coupures (en moyenne).
6. Un plasmide circulaire a 3 sites BamHI. Combien de fragments après la coupure par BamHI ? Et pour un ADN droit (linéaire) avec 3 sites ?
Un cercle coupé en 3 points donne 3 morceaux. Une ligne droite coupée en 3 points donne 3 + 1 = 4 morceaux. C'est pourquoi un vecteur ne doit avoir qu'un seul site pour une enzyme.
7. Un gène est inséré au site BamHI dans tetR de pBR322. Sur quelles boîtes les cellules recombinantes poussent-elles ?
tetR est cassé (inactivation par insertion), ampR fonctionne toujours. Donc les cellules recombinantes poussent sur ampicilline mais PAS sur tétracycline. Les cellules avec plasmide non recombinant poussent sur les deux.
8. Trois morceaux d'ADN de 500 pb, 2000 pb et 5000 pb migrent sur un gel. Lequel est le plus proche des puits ?
Les gros morceaux avancent moins dans le tamis. Donc 5000 pb reste le plus près des puits ; 500 pb va le plus loin vers l'anode.
Erreurs fréquentes
- Dire que l'ADN va vers la cathode en électrophorèse sur gel. L'ADN est négatif, donc il va vers l'anode (+).
- Utiliser des enzymes de restriction différentes pour le gène et le vecteur et croire que les extrémités cohésives vont correspondre. Il faut la même enzyme.
- Penser qu'une colonie bleue est recombinante. Bleu veut dire que lacZ fonctionne encore, donc il n'y a PAS d'insert ; blanc = recombinante.
- Écrire que les enzymes de restriction sont des exonucléases. Elles coupent à l'intérieur de l'ADN, ce sont donc des endonucléases.