O DNA como material genético
Griffith (1928), transformação: bactérias Streptococcus pneumoniae vivas e inofensivas do tipo R + bactérias mortas pelo calor do tipo S (letal) → os camundongos morreram e foram encontradas bactérias S vivas. Algo das células S mortas 'transformou' R em S.
Avery, MacLeod e McCarty (1944): eles destruíram, um a um, os componentes do extrato S. Enzimas que digerem proteínas (proteases) e a RNase não impediram a transformação; a DNase impediu. Logo, o que transformava era o DNA.
Hershey e Chase (1952): cultivaram bacteriófagos com ³²P radioativo (vai para o DNA) ou ³⁵S radioativo (vai para a proteína). Depois da infecção e da agitação no liquidificador, as bactérias tinham ³²P, mas não ³⁵S. Portanto, é o DNA, e não a proteína, que entra na célula e leva as instruções.
O que faz um bom material genético?
- Consegue se copiar (replicar).
- É estável na química e na estrutura.
- Pode mudar devagar (mutar), o que permite a evolução.
- Consegue se expressar como características mendelianas.
O RNA é menos estável (o 2′-OH o deixa reativo), por isso o DNA é melhor para guardar informação; o RNA serve melhor para tarefas rápidas. Provavelmente o RNA foi o primeiro material genético (mundo de RNA).
Estrutura do DNA e do RNA
Um nucleotídeo = base nitrogenada + açúcar pentose + fosfato. Base + açúcar = nucleosídeo. Purinas: adenina (A) e guanina (G). Pirimidinas: citosina (C), timina (T, só no DNA) e uracila (U, só no RNA). O açúcar do DNA é a desoxirribose; o do RNA é a ribose.
Os nucleotídeos se unem por ligações fosfodiéster 3′–5′. Watson e Crick (1953), usando as imagens de raios X de Rosalind Franklin e Wilkins, propuseram a dupla hélice:
- Duas cadeias antiparalelas (5′→3′ e 3′→5′).
- A=T (2 ligações de H), G≡C (3 ligações de H). Uma purina sempre fica de frente para uma pirimidina, então a largura se mantém em 2 nm.
- Giro para a direita; uma volta = 3.4 nm = 10 pares de bases; distância entre pares = 0.34 nm.
- Regra de Chargaff: A = T e G = C, portanto (A + G) = (C + T).
O RNA geralmente tem uma só cadeia. Tipos: mRNA (mensageiro), tRNA (adaptador) e rRNA (parte do ribossomo).
Empacotamento do DNA
Comprimento do DNA = número de pares de bases × 0.34 nm. Célula humana diploide: 6.6 × 10⁹ pb × 0.34 × 10⁻⁹ m ≈ 2.2 m, guardados num núcleo de cerca de 10⁻⁶ m de largura.
- Procariontes: não têm núcleo. O DNA, de carga negativa, é seguro por proteínas de carga positiva numa região chamada nucleoide, em alças.
- Eucariontes: o DNA (negativo) se enrola em histonas (positivas, ricas em lisina e arginina). Oito histonas formam um octâmero de histonas; cerca de 200 pb de DNA o envolvem = um nucleossomo. Nucleossomos em fila parecem 'contas num colar' → fibra de cromatina → enrolamento maior → cromossomo na metáfase. Proteínas cromossômicas não histonas (NHC) ajudam no empacotamento seguinte.
Eucromatina: frouxa, cora pouco, ativa. Heterocromatina: compacta, cora forte, inativa.
Replicação do DNA (semiconservativa)
Watson e Crick previram que cada cadeia serve de molde. Meselson e Stahl (1958) provaram isso: cultivaram E. coli em ¹⁵N pesado e depois passaram para ¹⁴N normal. Após 1 geração, todo o DNA era híbrido (¹⁵N–¹⁴N); após 2 gerações, metade era híbrida e metade leve. Taylor mostrou o mesmo em pontas de raiz de feijão, usando timidina radioativa.
Como acontece
- A helicase abre a hélice na origem de replicação, formando a forquilha de replicação em forma de Y.
- A DNA polimerase dependente de DNA adiciona nucleotídeos somente no sentido 5′→3′, usando desoxinucleosídeos trifosfatados (que fornecem tanto a peça quanto a energia).
- Numa das cadeias o DNA novo cresce de forma contínua (cadeia líder); na outra é feito em pedaços curtos (cadeia atrasada, fragmentos de Okazaki).
- A DNA ligase une os pedaços.
É muito rápida (a E. coli copia 4.6 × 10⁶ pb em cerca de 18 minutos, mais ou menos 2000 pb por segundo) e muito precisa. Nos eucariontes ocorre na fase S.
Dogma central
Francis Crick propôs que a informação genética flui de DNA → RNA → proteína. DNA → DNA é a replicação, DNA → RNA é a transcrição e RNA → proteína é a tradução.
A transcrição reversa (RNA → DNA) acontece em alguns vírus, como o HIV, com a enzima transcriptase reversa. Ou seja, o fluxo às vezes pode ir no sentido contrário (dogma central invertido).
Transcrição
Só uma cadeia é copiada. A cadeia molde (3′→5′) é lida; a outra é a cadeia codificante (5′→3′), que tem a mesma sequência do RNA, exceto T no lugar de U.
Uma unidade de transcrição tem um promotor (antes do gene, onde a RNA polimerase se liga), o gene estrutural e um terminador.
Nas bactérias
Uma única RNA polimerase faz todos os RNAs. Com o fator σ (sigma) ela começa (iniciação), faz o RNA crescer (alongamento) e, com o fator ρ (rô), para (terminação). A transcrição e a tradução podem ocorrer ao mesmo tempo porque não há núcleo.
Nos eucariontes
- RNA pol I → rRNAs (28S, 18S, 5.8S); RNA pol II → hnRNA (precursor do mRNA); RNA pol III → tRNA, rRNA 5S, snRNA.
- Os genes são interrompidos: éxons (expressos) e íntrons (intercalados). O hnRNA é processado: o splicing retira os íntrons; o capeamento acrescenta metilguanosina trifosfato na ponta 5′; a poliadenilação acrescenta 200–300 adeninas na ponta 3′ (cauda poli-A).
Código genético
George Gamow raciocinou: 4 bases precisam codificar 20 aminoácidos. 4¹ = 4 e 4² = 16 são poucos; 4³ = 64 é suficiente. Então o código é de trincas. Nirenberg, Khorana e Ochoa descobriram os códons.
- 64 códons: 61 codificam aminoácidos e 3 são de parada (UAA, UAG, UGA).
- AUG = metionina e também o códon de início (função dupla).
- Não ambíguo e específico: um códon → um aminoácido.
- Degenerado: muitos aminoácidos têm mais de um códon.
- Lido sem vírgulas, em quadro contínuo.
- Quase universal: UUU = Phe em bactérias e em humanos (com poucas exceções nas mitocôndrias).
Mutações e o código
Uma mutação pontual (uma base trocada) pode mudar um aminoácido (anemia falciforme). A inserção ou a perda de 1 ou 2 bases desloca o quadro de leitura (mudança de fase); acrescentar ou retirar 3 bases acrescenta ou retira um aminoácido e mantém o quadro. O tRNA é o adaptador: a alça do anticódon lê o códon e a ponta 3′ (CCA) carrega o aminoácido. Em 2D ele parece um trevo; em 3D, um L invertido.
Tradução
- Carregamento do tRNA (aminoacilação): cada aminoácido é preso ao seu tRNA, gastando ATP.
- Iniciação: a subunidade menor do ribossomo encontra o mRNA no AUG; a subunidade maior se junta. O ribossomo tem dois sítios para tRNAs.
- Alongamento: os tRNAs trazem aminoácidos códon por códon; formam-se ligações peptídicas (o rRNA 23S age como enzima, uma ribozima). O ribossomo avança no sentido 5′→3′.
- Terminação: num códon de parada, um fator de liberação solta o polipeptídeo.
O mRNA também tem regiões não traduzidas (UTRs) antes do AUG e depois do códon de parada; elas ajudam a tradução a ser eficiente.
Regulação da expressão gênica: o operon lac
As células só ligam os genes quando precisam deles. Nas bactérias, vários genes de uma mesma tarefa ficam juntos, com um promotor e um operador = um operon. Jacob e Monod descreveram o operon lac da E. coli:
- gene i: produz a proteína repressora (sempre ligado).
- gene z: β-galactosidase, que quebra a lactose em glicose e galactose.
- gene y: permease, que deixa a lactose entrar na célula.
- gene a: transacetilase.
Sem lactose: o repressor fica sobre o operador e bloqueia a RNA polimerase → genes desligados.
Com lactose: a lactose (o indutor) se liga ao repressor, muda a forma dele, e ele sai do operador → a RNA polimerase transcreve z, y, a → as enzimas são produzidas. Isso é regulação negativa de um operon induzível. Quando a lactose acaba, o repressor volta a se ligar.
Projeto Genoma Humano e genoma do arroz
O Projeto Genoma Humano (HGP) durou de 1990 a 2003 e leu os cerca de 3 × 10⁹ pb do DNA humano. Métodos: Etiquetas de Sequências Expressas (achar os genes expressos) e anotação de sequência (ler tudo e depois achar os genes). O DNA foi cortado em pedaços, clonado em vetores BAC/YAC, sequenciado por máquinas automáticas (método de Sanger) e montado por computadores usando as sobreposições.
Principais descobertas
- Cerca de 3164.7 milhões de pb; um gene médio tem cerca de 3000 bases; o maior gene, a distrofina, tem 2.4 milhões de bases.
- Cerca de 30,000 genes (bem menos do que se pensava); 99.9% das bases são iguais em todas as pessoas.
- Menos de 2% do genoma codifica proteínas; grandes partes são repetições.
- O cromossomo 1 tem mais genes (2968); o Y tem menos (231).
- Cerca de 1.4 milhão de pontos com diferença de uma única base (SNPs).
Outros organismos sequenciados incluem o arroz, bactérias, levedura, Caenorhabditis elegans, a mosca-da-fruta e a Arabidopsis. O genoma do arroz ajuda a achar genes de produtividade, resistência a doenças e tolerância ao estresse.
Impressão digital de DNA
99.9% do DNA é igual em todos os humanos, então comparamos os 0.1% que diferem, principalmente o DNA repetitivo. Quando o DNA é centrifugado em gradiente de densidade, as repetições formam pequenos picos chamados DNA satélite. Eles não codificam proteínas e variam muito de pessoa para pessoa (polimorfismo). Alec Jeffreys desenvolveu o método usando VNTRs (Número Variável de Repetições em Tandem).
- Isolar o DNA (sangue, raiz de cabelo, saliva, sêmen).
- Cortá-lo com enzimas de restrição.
- Separar os fragmentos por eletroforese em gel.
- Transferir para uma membrana de náilon/nitrocelulose (Southern blotting).
- Adicionar uma sonda de VNTR marcada, que gruda nos pedaços correspondentes (hibridização).
- Detectar as bandas em filme de raios X (autorradiografia).
Um filho recebe metade das bandas da mãe e metade do pai. Usos: casos forenses, testes de paternidade, estudos de populações e de evolução. A PCR pode multiplicar amostras minúsculas antes.
Fórmulas e definições principais
- Pareamento de bases: A = T (2 ligações de H), G ≡ C (3 ligações de H)
- Chargaff: A = T, G = C, logo A + G = C + T (purinas = pirimidinas)
- Comprimento do DNA = número de pb × 0.34 nm
- Uma volta da hélice = 10 pb = 3.4 nm
- Códons = 4³ = 64 (61 com sentido + 3 de parada)
- Aminoácidos numa proteína = (bases codificantes ÷ 3) − 1 códon de parada
- Meselson–Stahl após n gerações em ¹⁴N: fração híbrida = 2/2ⁿ, leve = 1 − 2/2ⁿ
Exemplos resolvidos
1. Uma amostra de DNA tem 20% de adenina. Ache a % de T, G e C.
Passo 1: A = T, então T = 20%. Passo 2: A + T = 40%, então G + C = 60%. Passo 3: G = C = 30% cada.
2. Uma molécula de DNA tem 1000 pares de bases, dos quais 300 são pares A–T. Quantas ligações de hidrogênio unem as duas cadeias?
Passo 1: pares G–C = 1000 − 300 = 700. Passo 2: ligações de H = 300 × 2 + 700 × 3 = 600 + 2100. Resposta: 2700 ligações de H.
3. Ache o comprimento de uma molécula de DNA com 5386 pares de bases (o tamanho do fago φX174).
Passo 1: comprimento = pb × 0.34 nm. Passo 2: 5386 × 0.34 = 1831.24 nm. Resposta: cerca de 1.83 µm.
4. Escreva o mRNA feito a partir da cadeia molde 3′-TACGCAATG-5′.
Passo 1: pareie cada base: T→A, A→U, C→G, G→C. Passo 2: mRNA 5′-AUGCGUUAC-3′. Passo 3: ele é igual à cadeia codificante 5′-ATGCGTTAC-3′, com U no lugar de T.
5. Um mRNA diz 5′-AUG UUU GGC AAA UGA-3′. Quantos aminoácidos terá a proteína e quais?
Passo 1: leia os códons: AUG (Met), UUU (Phe), GGC (Gly), AAA (Lys), UGA (parada). Passo 2: a parada não acrescenta aminoácido. Resposta: 4 aminoácidos: Met–Phe–Gly–Lys.
6. Uma proteína tem 300 aminoácidos. Qual é o número mínimo de bases na parte codificante do mRNA (com o códon de parada)?
Passo 1: 300 códons de aminoácidos + 1 de parada = 301 códons. Passo 2: 301 × 3 = 903 bases.
7. Uma E. coli com DNA só de ¹⁵N é passada para meio com ¹⁴N. Depois de 3 gerações, que fração das moléculas de DNA é híbrida?
Passo 1: moléculas após 3 gerações = 2³ = 8 (a partir de uma). Passo 2: só 2 mantêm uma cadeia antiga de ¹⁵N → híbridas. Passo 3: 2/8 = 1/4 híbridas, 6/8 = 3/4 leves.
8. No mRNA AUG CCU AAA UGA, uma base (o C da posição 4) é perdida. O que acontece?
Passo 1: nova sequência AUG CUA AAU GA… Passo 2: os códons mudam depois da perda: Met–Leu–Asn… Passo 3: é uma mutação de mudança de fase: todos os aminoácidos seguintes mudam e o códon de parada pode se perder.
Erros comuns
- Dizer que a cadeia codificante é copiada na transcrição. A cadeia molde é a lida; o RNA é igual à cadeia codificante (com U).
- Contar o códon de parada como aminoácido. Códons de parada não acrescentam nada.
- Achar que o repressor do operon lac só é produzido quando falta lactose. O gene i está sempre ligado; a lactose apenas desliga o repressor.
- Usar a regra de Chargaff para DNA de cadeia simples ou para RNA. A = T e G = C só valem para cadeias duplas.